2.1 枯草芽孢桿菌生長條件測定
枯草芽孢桿菌屬于細(xì)菌的一科，屬于厚壁菌門，在發(fā)酵飼料中芽孢桿菌主要發(fā)揮兩大作用，一方面是提高飼料的消化性和營養(yǎng)價值，另一方面是產(chǎn)生抗菌肽和細(xì)菌素抑制有害菌的生長和腐敗作用，芽孢桿菌不僅可以促進(jìn)多糖、淀粉和蛋白質(zhì)的水解，還可以促進(jìn)共生的乳酸菌生長，具調(diào)查攝食枯草芽孢桿菌飼料的動物發(fā)育良好，血清中溶菌酶水平提高，致使疾病率與死亡率均顯著下降。
通過圖1、圖2 可以看出，隨著培養(yǎng)基pH 的升高，枯草芽孢桿菌的菌濃度隨之增加；隨著培養(yǎng)溫度的提高，枯草芽孢桿菌的生長速度明顯加快，但OD值隨之降低。根據(jù)菌種活力以及穩(wěn)定性等多方面因素考慮，選擇30 ℃、pH7.0為枯草芽孢桿菌的最適條件。
2.2 乳酸菌生長條件測定
乳酸菌同樣屬于細(xì)菌的一個分支厚壁菌門，乳酸菌是飼料中應(yīng)用最早、最廣泛的菌類，在飼料中發(fā)揮以下作用：產(chǎn)生抗菌素抑制和殺滅有害菌使其不能生長繁殖，減少或殺滅有害物質(zhì)，使動物體內(nèi)毒素含量降低從而增強使原宿主抗異能力，增強在競爭中占優(yōu)勢；提高飼料的營養(yǎng)價值，在活菌體內(nèi)和代謝產(chǎn)物中含有較高的超氧化物歧化酶可以增強動物的體液免疫和細(xì)胞免疫；將糖類分解改善物料風(fēng)味和適口性。
通過圖3、圖4 可以看出，在32 ℃和35 ℃培養(yǎng)溫度下，乳酸菌的生長速率相差不大，在37 ℃時，乳酸菌生長速率明顯增高，但最終OD 值略低于采用35 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；在不同pH培養(yǎng)基環(huán)境下，前期菌液的OD 值并未呈現(xiàn)出非常明顯的差別，但隨著培養(yǎng)時間的延長，高pH 的試驗組OD 值開始呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。根據(jù)菌種活力以及穩(wěn)定性等多方面因素考慮，選擇35 ℃、pH5.0為乳酸菌的最適條件。
2.3 玉米秸稈與豆粕混合發(fā)酵參數(shù)測定
由于試驗因素較多，對全部因子進(jìn)行交互試驗，費時費力，因此，利用minitab 軟件進(jìn)行輔助，設(shè)計部分因子試驗，以之前試驗出的乳酸菌和枯草芽孢桿菌最適生長條件為界限，擬定試驗因子為pH(最小值5.0、最大值7.0)、溫度(最小值30 ℃、最大值35 ℃)、水分(最小值35%、最大值40%)、乳酸菌接種量(最小值1‰、最大值5‰)、枯草芽孢桿菌接種量(最小值1‰、最大值5‰)，具體設(shè)計如下：每個試驗組重復(fù)進(jìn)行三次試驗，在發(fā)酵過程第1、3、7、15 d分別對各試驗組取樣進(jìn)行顏色、氣味、酸度、水分、微生物數(shù)量等檢測、并根據(jù)各試驗組發(fā)酵水平，進(jìn)行綜合評定，將綜合評定值平均平均數(shù)返回設(shè)計軟件，通過回歸方程，經(jīng)層層刪減，計算各因子影響性（表1-2）。
通過軟件計算，得出模型及回歸方程，其R-sq=99.63%、R-sq（調(diào)整）=99.06%，說明刪去所有影響不顯著項后的模型結(jié)構(gòu)較好，回歸方程具有較好的預(yù)測能力。其控制方程式（精簡模式）如下：綜合評定值=6.2062+0.1812 水分-0.0312pH+0.1438 溫度 +0.9313 乳酸菌接種量-0.6187 枯草芽孢桿菌接種量-0.1812水分×溫度-0.0813pH×乳酸菌接種量+0.1937pH×枯草芽孢桿菌接種量-0.1063溫度×枯草芽孢桿菌接種量（圖5）。
通過效應(yīng)Pareto 可以看出，試驗的關(guān)鍵因子為D、E、BE、A、AC、C、CE、BD，即乳酸菌接種量、枯草芽孢桿菌接種量、pH×枯草芽孢桿菌接種量、水分、水分×溫度、溫度、溫度×枯草芽孢桿菌接種量、pH×乳酸菌接種量（圖6）。
通過主效應(yīng)圖可以看出，乳酸菌接種量和枯草芽孢桿菌接種量的斜率較大，說明其對發(fā)酵的影響顯著，水分、溫度、pH的斜率較為平緩，說明其對發(fā)酵的影響不顯著。因子的重要順序為D＞E＞A＞C＞B（乳酸菌接種量＞枯草芽孢桿菌接種量＞水分＞溫度＞pH）。
通過交互作用圖可以看出，水分與pH、水分與溫度之間存在著一定的交互作用外，其余因子間不存在明顯的交互作用關(guān)系（圖7-8）。
通過相應(yīng)優(yōu)化器，利用控制方程式對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，得出最佳操作水平為pH 5.5、溫度35 ℃、配料水分40%、乳酸菌接種量5‰、枯草芽孢桿菌接種量1‰。
采用最佳操作水平數(shù)據(jù)對進(jìn)行試驗，以驗證結(jié)果的穩(wěn)定性，通過試驗發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵15 d時，飼料具氣味芳香，顆粒松散，乳酸菌活菌數(shù)＞4×107CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)＞2×107 CFU/g最終評價值為8.9，優(yōu)于其他試驗組。
由于研究方向以及設(shè)備儀器的原因，本次實驗主要對發(fā)酵飼料感官評價及益生菌數(shù)量，進(jìn)行了比較，并未對發(fā)酵前后的小肽類、氨基酸類等微量營養(yǎng)成分，以及飼料的消化能。代謝能等進(jìn)行詳細(xì)檢測，后續(xù)我們將對飼料發(fā)酵前后小肽、氨基酸、微量元素的變化，并開展動物飼喂研究，以找出最優(yōu)發(fā)酵方案。
結(jié) 論
經(jīng)過初步研究，采用pH5.5、溫度35 ℃、配料水分40%、乳酸菌接種量5‰、枯草芽孢桿菌接種量1‰作為工藝條件進(jìn)行發(fā)酵時，能獲得較高的益生菌數(shù)量和較優(yōu)的感官評價結(jié)果，發(fā)酵效果較好。
